炭疽細菌學(xué)檢查

A1 標本的采取

A1.1 采取標本時必須遵循的兩條原則

A1.1.1 盡可能在抗生素治療開始前采取標本。

A1.1.2 除必要時并在具備操作病毒細菌條件的實驗室內(nèi)，不得用解剖的方式獲取標本。所需的血液與組織標本，均應(yīng)以穿刺方式取得。

A1.2 血液標本

所有的疑似人類病例和病畜，都應(yīng)采取血液標本，標本量至少應(yīng)滿足下列檢查的需要：

a）涂片進行顯微鏡檢查；

b）接種培養(yǎng)基進行細菌分離培養(yǎng)；

c）分離血清檢查抗體；

d）常規(guī)血液檢查。

A1.3 糞便與嘔吐物標本

表現(xiàn)消化道癥狀的可疑病人收集糞便或嘔吐物標本，特別注意選取其中混有血液的部分，置無菌容器中。

A1.4 痰與咳碟標本

表現(xiàn)為呼吸道癥狀的可疑病人應(yīng)收集其痰液標本，無痰液者，應(yīng)取供細菌分離培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，打開平皿蓋置病人口鼻10cm處；令病人對平皿咳嗽，然后迅速蓋上平皿。

A1.5 腦脊液標本

表現(xiàn)腦膜刺激癥狀的病人，腰椎穿刺獲取腦脊液，標本量參照A1.2的要求。

A1.6 尸體標本

食草動物死于炭疽時，通常會從口、鼻、肛門等腔道開口流出血液，這種血液應(yīng)是首先采取的標本。如果血液已滲入土壤，則應(yīng)收集混有血液的土壤作為標本。沒有血液流出，或已不可能獲取血液標本時，可通過穿刺心臟獲得血液或穿刺肝臟等實質(zhì)性臟器獲得組織標本。

A1.7 肉類標本

如果懷疑罹患炭疽的家畜已被宰殺，或?qū)ι唐啡忸愡M行常規(guī)檢查時，可剪取小塊肉類標本。如有可能，特別應(yīng)剪取肝臟、脾臟等富含血液以及含淋巴組織的標本。

A1.8 毛皮或其他可疑污染物品標本

剪取小塊毛皮或其他可疑物品，剪碎置無菌試管內(nèi)，加適量無菌生理鹽水浸泡。

A1.9 水標本

檢查水體污染時，用廣口瓶收集水樣。如須取深層水樣時，將帶蓋廣口瓶伸入水中，然后將用繩系住的瓶蓋提起。

A1.10 土壤標本

在牲畜死亡或宰殺的地點，應(yīng)取土壤標本以供檢查。

A2 顯微鏡檢查

所有來自病人、病畜或尸體的標本，都應(yīng)首先進行顯微鏡檢查。

A2.1 復(fù)合負染法

將標本或懸液滴在載玻片上，立即加等量的炭素墨水，混勻推片。待干燥后滴加95%乙醇數(shù)滴，干燥后再以1%結(jié)晶紫液染1min，用水沖洗，干后用油鏡檢查。如果發(fā)現(xiàn)在細菌與炭素顆粒之間存在明顯的、連續(xù)的間隔帶，即說明細菌的周圍存在莢膜。

液體標本（如血液、腦脊液）和懸液標本（如糞便或混有血液的土壤）在能夠采取標本后立即進行顯微鏡檢查的情況下，推薦使用復(fù)合負染法。

A2.2 莢膜染色法

將標本涂片或印片干燥，妥善包裝后帶回實驗室，按常規(guī)方法固定，以美藍染液染色3～5min（如莢膜不清晰，染色時間可稍延長），水洗、干后鏡檢。菌體呈藍色，而莢膜呈紅色。

組織印片標本，或制片后無法立即進行顯微鏡檢查，或進行大面積普查時，推薦使用莢膜染色法。

A2.3 顯微鏡檢查結(jié)果判定

來自病人、病畜或尸體的標本中如發(fā)現(xiàn)由較寬的莢膜環(huán)繞的、兩端平齊的粗大桿菌，特別是鏡下發(fā)現(xiàn)大量、純一通常呈竹節(jié)狀的該種細菌，而且沒有明顯的其他細菌污染時，炭疽的診斷便可確立。

A3 細菌分離培養(yǎng)

A1 中所列的全部標本，均應(yīng)進行細菌分離培養(yǎng)。

A3.1 培養(yǎng)基

炭疽芽孢桿菌的分離培養(yǎng)應(yīng)同時用兩種培養(yǎng)基進行：常規(guī)的血瓊脂平板和選擇性平板。后者按如下處方配制：

蛋白胨 2g EDTA 0.03g

氯化鈉 0.5g 乙酸亞鉈 0.004g

醇母浸膏粉 0.5g 水楊素 1g

0.2%溴麝香草酚藍（BTB） 1.2mL 瓊脂粉 1.8g

加蒸餾水至100mL，調(diào)pH至7.6，121℃滅菌20min，冷卻至45～50℃時，加入：多粘菌素B（3000u/mL水溶液）0.1mL，溶菌酶（30000u/mL水溶液）0.1mL，混勻后傾注平板。

A3.2 標本處理

在正常情況下應(yīng)當(dāng)無菌的標本，如血液或腦脊液，直接涂布上述兩種平板，每平板0.1mL，組織標本應(yīng)先以無菌剪刀剪開一斷面，在培養(yǎng)基表面壓印，然后以白金耳涂開。

所有污染的和陳舊的標本，均應(yīng)首先制成懸液。根據(jù)標本中含菌量的多少，可將懸液適當(dāng)稀釋，或經(jīng)自然沉淀除去粗大沉淀物后，再3000r/min離心30min，取富集的沉淀物。將所得的懸液67℃加熱15min，冷卻后涂布上述兩種平板，每平板0.1mL。

A3.3 挑選可疑菌落

上述平板在37℃孵育過夜或24h后，檢查是否長出可疑的炭疽芽孢桿菌菌落。

炭疽芽孢桿菌在血瓊脂平板上的形態(tài)為：灰白色、不透明、中等大小，常不規(guī)則，表面呈毛玻璃樣，周圍無溶血環(huán)。

炭疽芽孢桿菌在選擇平板上菌落較血瓊脂平板上為小，具有類似表面特征，菌落呈藍綠色。但是，若遇菌落形態(tài)與以上描述完全一致但呈黃色的菌落，也應(yīng)進行A4的鑒定步驟。

A4 炭疽芽孢桿菌鑒定

將上述可疑菌落挑出，劃線接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板之上，在劃線區(qū)內(nèi)分別貼上浸有診斷用炭疽芽孢桿菌噬菌體和青霉素的紙片。37C孵育過夜或24h后，在兩種紙片的周圍均出現(xiàn)明顯的抑菌環(huán)，便可判定為炭疽芽孢桿菌。在病人、病畜或尸體中分離獲得炭疽芽孢桿菌，炭疽的診斷便可確立。